家畜繁殖学实验指导

实验二精子的活率和密度测定

一、目的和要求

掌握检查精子密度、评定活率的方法；熟悉肉眼检查精液品质的方法；验证观察理化因素对精子运动及生存能力的影响。

由于目测法不够准确，所以采用精子计数的方法，测定1ml精液内的精子数。不过要有一定经验才会准确。要求同学们一定要熟练掌握此法，它是目前许多简单而实用方法的基础。

二、材料和仪器

1．精液：牛、猪或兔等任一种动物的精液。

2．药品器械：显微镜、显微镜保温箱（或显微镜恒温台）、载玻片、盖玻片、搪瓷盘、温度计、滴管、擦镜纸、纱布、试管、75%酒精、5%伊红、1%苯胺黑、血细胞计数板、计数器、95%酒精、乙醚、0.9％和3%NaCl、保温瓶、药棉等。

三、内容和方法

（一）精子密度的检查（显微镜观测法）及活率评分

1．检查精子的密度：取一小滴精液于洁净的载玻上，盖上洁净的盖玻片，使精液分散成均匀的一薄层，不得有气泡存留，也不能使精液外流或溢出于盖玻片上。置于显微镜下放大100倍观察，按下列等级评定其密度。

密——在整个视野中精子的密度很大，彼此之间空隙很小，看不清各个精子个体运动的情况。每毫升精液含精子数约在10亿个以上。登记时以“密”字。

中——精子之间空隙明显，精子彼此之间的距离约有一个精子的长度，有些精子的活动情况清楚可见。这种精液的密度评为“中”，每毫升所含精子数约2～10亿个之间。登记时以“中”字。

稀——视野中精子稀疏、分散，精子之间的空隙超过一个精子的长度。这种精液每毫升所含精子数在2亿以下。登记时以“稀”字。

2．评定精子的活率：必须于采精后立刻在25℃左右的实验室内进行，最好在37℃保温箱内或加热的载物台上进行。在评定精子活率的同时也可以测定精子的密度。

用玻璃棒蘸取一滴原精液或经稀释的精液（马、猪精液的精子密度低，不须稀释；而牛、羊精液的密度大，须用0.9%氯化钠溶液稀释，其温度须与精液密度相近），滴在洁净的载玻片上，盖上洁净的盖玻片，其间充满精液，不存留气泡。也可滴在盖玻片上翻放于凹玻片的凹窝上。置于显微镜下，放大250～400倍检查。注意显微镜的载物台须放平，最好是在暗视野中观察。

精子活动有三种类型：直线前进运动、旋转运动和原地摆动。评价精子活率是根据直线前进运动精子数的多少而定。

精子活率＝×100%

分子也可用“总精子数-非直线前进运动精子数表示。

目前评定精子活率等级的方法有两种：

十级制——在显微镜视野中估算直线前进运动精子所占全部精子的百分数。直线前进运动的精子为100%者评为1.0级；90%者为0.9级。以此类推。

五级制——全部精子都呈直线前进运动，属于“5”级；绝大多数呈直线前进运动（约80%）为“4”级；前进运动精子略多于半数者（约60%）为“3”级；不及半数者为“2”级；呈直线前进运动的精子数目极少者属“1”级。

精子活率是精液品质评定的重要指标。受精能力与直线前进运动精子数的多少密切相关。一般活率在50～80%之间时，输精后受精力差别不大；而低于50%者，对于受精力影响较大。

（二）精子密度的计数检查

1.器材介绍：

（1）介绍血细胞计数室的构造。

（2）介绍血球吸管的构造及各种家畜应该使用何种血球吸管（红血球吸管或白血球吸管）。由于同学们在学习生理时已熟悉有关血细胞计数板的运用，故不再详述它的结构。

牛、羊、鸡的精液（密度高）用红血球吸管：若将精液吸至“0.5”刻度处，然后再吸3% NaCl至“101”刻度，为稀释200倍。如将精液吸至“1.0”刻度处，再吸3%NaCl至“101”刻度，则为稀释100倍。

猪、马、兔的精液（密度低）用白血球吸管：若将精液吸至“0.5”刻度处，然后再吸3%NaCl至“11”刻度，为稀释20倍。如将精液吸至“1.0”刻度处，再吸3%NaCl至“11”刻度，则为稀释10倍。

2.方法和步骤

（1）将计数室推上盖玻片。要求盖玻片被推上后以立起计数板不掉下来为原则，并且盖玻片在折光时可见到清晰的彩色条纹。

（2）将盖好盖玻片的计数板置于低倍镜下观察，首先要求找到清晰的计数室。

（3）用血球吸管吸精液，用药棉擦去吸管尖端外围附着的精液，并用3%NaCl稀释，因不同的家畜用不同的吸管稀释。

（4）吸管吸好精液和3%NaCl以后，用拇指及食指堵住吸管两端进行来回的充分摇动，混匀。然后弃去吸管中的前两滴，再将吸管尖端置于血球计数室和盖玻片交界处的边缘上，吸管内的精液自动渗入计数室内，使之自然、均匀地分充满计数室。注意不要使精液溢出盖玻片，也不可因精液不足而使计数室内有气泡或干燥处，否则，应重新操作。静放2分钟，开始计数。

（5）镜检和计数：移到高倍镜下检查。

首先数出四角和正中间的五个方格中的精子数，也就是80个小方格中的精子数。载物台要平置，不能斜放。光线不必过强。

计算精子数：5个方格中共数的精子数×5＝整个计数室中25个中方格内的精子总数。也就是1m2×1/10mm＝1/10mm3的精子。如果再×10，就＝1mm3精液内的精子数。再×1000＝1ml精液内的精子数（因为1cm3为1ml）。再×稀释倍数。如果取来的精液本身不是原精液，而是经稀释“X”倍，那么还须再×“X”倍。将以上的结果总括起来说：

1ml原精液内的精子数＝5个中方格数的精子数×5×10×1000×稀释倍数× X（如果是原精液不要×“X”）。

注：（1）一般羊的精子密度大约为20～30亿／ml；

一般牛的精子密度为10～15亿／ml；

一般猪、马的精子密度为1～1.5亿／ml；

一般兔的精子密度为2～3亿／ml；

一般鸡的精子密度为35～38亿／ml。

（2）吸管用后清洗步骤：

自来水→蒸馏水→95％酒精→乙醚。

（3）计数板用后清洗方法:

自来水→蒸馏水→白稠布擦干净备用。

（4）也可用移液器稀释。

用移液器吸10μl精液＋1990μl（在小试管内先加2ml，再吸出10μl）的3%NaCl，即稀释200倍。同样，20μl精液用1980μl的3％NaCl稀释，即稀释100倍。以此类推。