家畜繁殖学实验指导

实验七精子顶体染色

一、目的和要求

顶体在精子受精过程中起着重要的作用。因它能释放蛋白质分解酶消化卵丘细胞之间的粘合基质，使精子能够通过卵的被膜进行受精。由于顶体结构的畸形，可导致受精率降低或者不受精。精子老化或损伤，会引起顶体帽破坏，先是顶体嵴部分变化，最后整个顶体消失。这些变化可用电镜观察到。但用微分干涉显微镜及相差显微镜也能看到。精液冷冻解冻会损伤一些精子，重要的是要准确知道受伤精子百分数。优质奶牛精液冷冻前，约90％精子具有完整的顶体。冷冻后下降至60％～65％。研究表明，顶体完整率和不返情率之间比精子活率与不返情率之间的相关性更强。因而，检查精子顶体完整率很重要。

通过本实验，要求：1）学习精液抹片染色技术；2）观察正常精子顶体和异常精子顶体形态，计算精子顶体完整率。

二、材料和仪器设备

（一）二人一组，每组所需材料及器材：

烧杯2个（大小均可，用于清洗染色片用）；玻璃滴管2支；小磁盘、染色架各一个；卫生纸（垫在小磁盘内，以免磁盘被颜色污染）；玻璃平皿1个；切片盒一个；血球计数器2个；普通光学显微镜1台；镊子1把。

（二）公用器材

酒精棉球；姬姆萨（Giemsa）原液（预先一个月前配好）；固定液；擦镜纸；精液；蒸馏水；玻璃移液管；玻璃滴管2支，小镊子2把；pH试纸；玻璃棒2支。

（三）试液的配制：

1．磷酸盐缓冲液：

Na2HPO4·12H2O2.2g

NaH2PO4·2H2O0.55g

先用少量蒸馏水溶解，再用蒸馏水定容至100ml

用pH试纸测pH值，应为7.0～7.2。

2．福尔马林磷酸盐固定液：

（1）Na2HPO4·12H2O2.25gNaH2PO4·2H2O0.55g

置于100ml容量瓶中，加入0.89％NaCl溶液约30ml，使之溶解。

（2）加入甲醛MgCO3饱和液8ml

甲醛MgCO3饱和液配制方法：在500ml福尔马林（40％甲醛）中加入8g MgCO3。此饱和液必须在一周前配好。

（3）用0.89％NaCl溶液少许冲洗装过甲醛的量筒置于容量瓶中，并定容至100ml。此液配好后，第二天即可用。一般在室温下保存。此液pH 为7.0～7.2。

3．Giemsa原液：

Giemsa原料：1g甘油：66ml甲醇：66ml

将Giemsa染料置于研钵中，先加入少量温热（60℃）的甘油，充分研磨至无颗粒呈浆糊状。再将剩余甘油全部倒入，置56℃恒温箱中保温2小时。分次用甲醇清洗容器于棕色瓶中保存。保持一个月后才能使用。此原液放置时间越长越好，但使用前需经过滤。

4．Giemsa染液：必须在染色前配制。

Giemsa原液 : 缓冲液 : 蒸馏水的比例为2 : 3 : 5。

例如做40个片子，每个片子需用2ml染液。因此需配80ml新鲜染液。则分别取Giemsa原液16ml、缓冲液24ml、蒸馏水40ml。混匀即可。

三、顶体染色方法步骤：

先准备洁净的载波片。用洗涤灵擦洗，清水冲洗，再用蒸馏水漂洗，以不挂水珠为净。烘干或晾干备用。

1．抹片：将需测定的样品摇匀，取1滴中层精液平滴于载玻片的右端，取另一张边缘光滑平直的载玻片，呈35°角自精液滴的左面向右接触样品，样品精液即呈条状分布在两个载玻片接触边缘之间。将上面的载玻片贴着平置的载玻片表面，自右向左移动，带着精液均匀地涂抹在载玻片上。切忌直接将精液滴“推”过去，人为造成精子损伤。在制作的抹片背面右端用特种记号笔编号。每份精液样品需同时制作两个抹片。

2．风干：自然风干5～20min。

3．固定：将风干的抹片平置于染色架上，用滴管吸取1ml固定液，滴于抹片上，并使固定液布满于整个抹片表面。静止固定15min。

4．水洗：用玻片镊夹住抹片一端，将固定液弃去倒入染色缸或平皿内，在装有蒸馏水的烧杯中，上下左右摇晃涮洗，夹住松开镊子几次，取出抹片于磁盘边，待干。

5．染色：将固定后的抹片平置于染色架上，用滴管吸取新配制Giemsa染液约2ml，置于要染的玻片上方平行。自左至右挤出染液于抹片上，使染液均匀布满在抹片上。静止染色90min。

6．水洗：用镊子夹住染片，将染片上的染液弃去倒入平皿内，再在装有自来水的烧杯中冲洗，冲洗方法同上。经数次涮洗，直至水洗液无色为止。洗的过程中，若水已变蓝，则可及时换清水。洗净后可立于磁盘边，待干。

四、精子顶体观察

将精液染片置于显微镜下，先用低倍镜找到精子，再在1000倍下进行油镜观察。精子顶体呈紫色，包围精子头前部。

根据精子顶体完整和损伤与否，将精子顶体形态分为4种类型：

1．顶体完整型：精子头部外形正常，着色均匀，顶体完整，边缘整齐，可见微隆起的顶体嵴，赤道带清晰。

2．顶体膨胀型：顶体轻微膨胀，边缘不整齐，顶体嵴肿胀，核前细胞膜不明显或缺损。

3．顶体破损型：顶体破损，精子质膜严重膨胀破损，着色浅且不均匀，头前部边缘不整齐。

4．顶体全脱型：精子顶体全部脱落，精子核裸露。